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细胞趋化实验新方法：可实时观察细胞动态
2016-04-26 17:10:01 来源：
细胞趋化性（Chemotaxis，亦被称为化学趋向性）是趋向性的一种，指细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。趋化性对细胞的发展和其他正常功能一样不可或缺。
在这里，我们以小鼠树突状细胞为例，介绍一个细胞的化学趋化实验。
一、实验材料准备：
- 仪器：
- 细胞培养箱（高湿度，37℃，5%CO2）
- 倒置显微镜，具有10X相差物镜和定时拍照功能
- 镜载加热孵育系统（37℃，5%CO2）
- 可选配置：全自动载物台，自动对焦系统
- 分析软件：可选用手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块，或全自动的ibidi提供的WimTaxis进行细胞轨迹追踪。*后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 进行数据统计分析。
- 树突状细胞：
为了减少ibidi细胞趋化载玻片与培养基中的气泡，将载玻片和培养基提前24小时放入培养箱中
将8-10天的树突状细胞用200 ng/ml LPS 过夜处理（培养基等试剂见表一）
表一：细胞培养和活化所需的试剂盒培养基
*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)
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基质胶制备，Collagen I，bovine，1.6mg/ml
树突状细胞的化学趋化实验所需的试剂如下：
表二：化学趋化需要的耗材和试剂
表三：制备1.6mg/ml 基质胶
操作步骤：
- 使用表一中的培养基制备 9 x 106 cells/ml 的细胞悬液
- 在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂，避免产生气泡
- 在另一1.5ml离心管中准备150 μl collagen
- 使用200μl枪头从第二步的混合液中吸取30μl（图一A）
- 小心混匀（图一B），避免产生气泡
- 加入90μl细胞悬液到上一步混合液中（图一C）
- 小心混匀（图一D），避免产生气泡
图一：制备细胞-基质胶混合液图示，注意：1）避免产生气泡，气泡会破坏胶原纤维，不能使用Vortex；2）胶原混合后，离胶凝大约有5分钟时间，如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维；3）当刚加10x MEM到NaHCO3中的时候会看到颜色变化，这表明没有充分反应，因此加入混合液到胶原蛋白中后要充分混匀。
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细胞趋化实验
- 趋化试剂
- 化学趋化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）
- 无化学趋化物培养基：RPMI1640，10%FCS
- 实验步骤
- 当细胞-基质胶混合液制备好后直接加入ibidi细胞趋化载玻片的中间通道中（图二）
图二，在观测通道中加入细胞-基质胶混合液
- 将细胞趋化载玻片放入培养箱中30-35分钟，等待胶原蛋白凝固
图三：加入化学趋化物（红色）和无化学趋化物培养基（蓝色）
在两边储液池中均加入60μl的无化学趋化物培养基作为空白对照（-/-）（图四）
图四：加入无化学趋化物培养基（蓝色）作为空白对照
- 按说明，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集
- 将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，进行4小时的观测，每2分钟采集一张图片
图五：明场1小时处图像采集，由于是3D培养环境，不是所有的细胞都能被清楚的成像。
- 图像处理
- 手动细胞轨迹追踪
- 下载ImageJ，并安装Manual Tracking模块
- 导入采集的系列图像到ImageJ中，打开模块“Manual Tracking”，选择“Add track”开始记录细胞轨迹
- 选择一个细胞，按照时间点单击细胞，*点击后，会有新窗口跳出来显示初始位置，以后每次点击，都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标
- 统计完足够的细胞轨迹后，保存轨迹坐标表格
- 至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义，避免同一细胞追踪两次，去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞
- 可以将“Overlay dots & lines”以.avi格式导出
2）全自动细胞轨迹追踪
使用ibidi的WimTaxis自动分析平台，将采集的系列图像上传到该平台，几个工作日后，会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。
四、数据处理
使用迁移指数（ Forward Migration Indices*，FMIs）作为比较趋化实验和对照试验的参数。在有趋化物的情况下，空白对照的FMI和与趋化物垂直方向的化学趋化的迁移指数（FMI┴）应是在0点左右。而与趋化物平行方向的化学趋化的迁移指数（FMI‖）与0点有显著的区别表现出了化学趋向性。同时，使用Rayleigh Test**对细胞趋化的方向性进行检验。如果p值大于0.05表示了细胞运动的无序性，表明没有方向性的迁移。此外，迁移速率等参数也能直接用于分析。
*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)
**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993)
五、统计结果：
六、实验优势总结
1.可实时观察细胞趋化情况；
2.可计算细胞的趋化速率；
3.在1组实验中即可做出连续性趋化浓度梯度；
4.建立的浓度梯度可维持长达48小时，对快速迁移细胞或慢速迁移细胞都适用；
5.可选配套的图像分析，轻松得到实验数据。
留 言
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